斑点杂交条件的建立及优化
斑点杂交条件的建立及优化
（3）以（2）所获得的最佳条件，改进以下条件：①杂交后洗涤时间每次1h;每次30min；每次10min；②封闭液封闭时间2h;1.5h;50min；③封闭后洗涤时间由每次1h;每次40min;每次20min；④检测缓冲液平衡时间由1h；30min;10min；⑤显色以出现清晰的阳性信号，本底最低为尺度，一般在15min左右，时间延长本底升高。
1.3 斑点杂交法检测K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株pp-GalNAcT2的表达差异 NIH3T3成纤维细胞、胃癌细胞株SGC-7109、白血病细胞株K562和NB4购自上海生化细胞所；RNA抽提试剂TRIZOL、PCR试剂盒、pUC Mix DNA marker和ladder购自Invitrogen公司，六随机引物购自Takara公司。实验所用pp-GalNAcT2和β微球蛋白（内对照）引物采用Genetyx软件设计，并经GenBank Blast同源检索后由上海生工生物技术公司合成。
β-MG引物序列为：
F： 5′- CTCGTGCTACTCTCTCTTTC-3′
R： 5′-CATGTCTCGATCCCACTTAAC-3′
预期扩增产物长度330bp。
ppGalNAc-T2引物为：
F： 5′-GAAAGAATTAGGAAGGGTCAGAAC -3′
R： 5′-CTGTGTCAATGTAAACATAGCTC -3′
预期扩增产物长度为668bp。
采用TRIZOL法抽提K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株RNA，测A260/A280比值和电泳图谱鉴定抽提完整性，测A260定量，六随机引物逆转录制作cDNA。倍比稀释点膜，用pp-GalNAcT2特异的寡核苷酸探针与膜杂交；同时以上述获得的K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株cDNA加pp-GalNAcT2和β-MG正反向引物行RT－PCR来验证斑点杂交结果。
2 结果
(1)尼龙膜上不点任何样品所进行的假杂交反应结果如图1所示，可见以杂交液中探针的终浓度为10ng/ml，酶的稀释比例为1／5000时本底最低；以此条件，在尼龙膜上点上pp-GalNAcT2 的cDNA片段，封闭液中BSA的浓度设计成2％、3％和5％三梯度，其余条件不变的杂交反应结果如图2所示，可见以5％的BSA封闭效果最佳；再以上述确立的条件改进杂交反应各步的时间，以简化实验，如图3所示，可见条件2和条件3 体系下的结果都是可以接受的，但条件3更为简化。
(2)以上述确立的杂交反应的条件用斑点杂交法检测K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株GalINAcT2的表达差异，以验证所确立的条件的实际可行性，结果如图4所示，pp-GalNAcT2的表达水平依次为K562白血病细胞>胃癌细胞SGC7901>NB4白血病细胞，在NIH3T3成纤维细胞中未检测到表达。同时再行RT-PCR确证斑点杂交的结果，如图5，6所示，与斑点杂交结果基本一致。
3 讨论
我们参照分子克隆［1］和Superarray［2］操作手册，设计并改进预杂交液和杂交液。由于采用带正电荷的尼龙膜为支持介质，在碱性条件下更有利于DNA与膜结合，而预杂交的目的是封闭膜上的非特异性结合部位，因此预杂交液采用pH7.5的PB配制并调终体积；而杂交液中的探针要尽量减少与膜的非特异性杂交，因此杂交液用水来调终体积，pH值控制在6.5左右。同时，对杂交过程中所涉及的每一个步骤及试剂的配制，我们都进行优化，最终所确立优化过程如下：采用自配的预杂交液和杂交液，杂交液中探针浓度为10ng/ml，杂交后洗涤液1和2各洗涤2次，每次10min，5%的BSA封闭液封闭50min，封闭后加酶稀释比为1／5000，封闭后洗涤液洗2次，每次20min，检测缓冲液平衡10min，显色以出现阳性信号，本底最低为标准。
图1 不同的探针及酶浓度进行假杂交反应
A：探针浓度为200ng/ml，酶浓度为1/400
B：探针浓度为100ng/ml，酶浓度为1/800
C：探针浓度为50ng/ml，酶浓度为1/2000
D：探针浓度为10ng/ml，酶浓度为1/5000
图2 三种不同BSA浓度显色对比
(A：BSA为5%；B：BSA为3%；C：BSA为2%)
图3 不同洗涤、封闭和显色时间的显色对比
A：条件1；B：条件2；C：条件3
