胃癌组织中SOX4基因的突变分析*
日期：2006-11-23 7:27:27
胃癌组织中SOX4基因的突变分析*
胃癌组织中SOX4基因的突变分析*
1.5 PCR扩增及产物克隆 引物参照人SOX4基因序列设计，A1：5′-GTG TGG TCG CAG ATC GAG CGG C-3′；A 2：5′-GCC ACT GCC ACC GAC CTT GTC T-3′，上海生工生物工程公司合成，PAGE纯化。该对引物可特异扩增人SOX4基因包括HMG-box在内的约350bp的碱基序列，PCR扩增反应体系25μl，循环参数：95℃预变性5min，94℃ 40s，62℃ 50s，72℃ 1min，30个循环，72℃延伸15min，设阴性对照以检测是否有外源DNA污染，分别取4μl扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶检测，拍照，余下的PCR产物用纯化试剂盒进行纯化。
2 结果
2.1 PCR扩增结果 27个标本中均有扩增产物。片段大小约为350bp，与正常人SOX4基因扩增一致。PCR扩增结果如图1；SSCP分析结果如图2。
图1 PCR扩增结果
M：DNA梯度；N：阴性对照
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13为癌组织，14为正常胃组织
图2 SSCP分析结果
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13为癌组织，14为正常胃组织
4、5为SOX4基因发生突变的癌组织
2.2 测序结果 PCR产物经纯化后由上海博亚生物技术有限公司测序，测序结果与正常SOX4序列比对，发现癌旁组织中无突变，而在癌组织中有12例有点突变，根据突变位点差异分为A、B、C、D四种类型，如图3所示。胃癌组织中SOX4基因四种突变类型编码氨基酸序列比较见图4。
3 讨论
SOX基因在哺乳动物进化中（包括人）是高度保守的，而其两侧的碱基变异较大，由此基因编码的一种蛋白质包含一个由70多个氨基酸残基组成的DNA结合区域，即HMG-box，HMG-box区的氨基酸也是高度保守，两侧表现很大的差异。SOX4基因属于SOX基因家族的C组，主要参与心脏管腔发育和B细胞发育。目前研究表明，SOX4基因的异常表达与多种疾病的发生有关，如急性髓细胞白血病、急生乳腺肿瘤、结肠癌、小细胞肺癌等［12］。SOX4基因的HMG结构域长79个氨基酸残基，可以以序列特异的方式与DNA的小沟结合使其产生较大的弯曲，从而调节靶基因的表达，所以相应的HMG盒内的突变(如错义突变)将影响其对下游调控基因的DNA序列的特异识别和结合，进而影响SOX4蛋白正常转录激活功能，导致疾病的发生。
本研究对胃癌组织标本DNA进行PCR扩增并测序发现，在27例标本中共有12例发生突变，且都为癌组织，癌旁组织中没有发现突变。根据突变位点差异，我们将其分成四种类型，A型5例：有7个点突变位点，分别是10451bp处C－A，10669bp处G-A，10682bp处G-C，10688bp处C-G ， 10702bp处 C-A， 10703bp处T-C， 10706bp处C-T；B型3例：有6个突变位点，10669bp处G-T ，10702bp处 C-T， 而10682bp、10688bp、10703bp、10706bp的突变与A型一致；C型3例：4个突变位点，分别是10682bp、10688bp、10703bp、10706bp，突变与A、B一致；D型1例：只有一个突变位点，位于10677bp处，由G-C。在所有突变中，只有A型的10451bp、10669bp和B型的10669bp处的突变在HMG盒内，其余均在HMG盒外。
对氨基酸序列分析发现，A型中10669bp处突变导致精氨酸（R）突变为谷氨酰胺 (Q)，10702bp处突变导致丙氨酸(A)突变为天冬氨酸(D)；B型中10669bp处突变导致精氨酸（R）突变为亮氨酸（L），10702bp处突变导致丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)；D型10677bp处突变导致谷氨酸(E)突变为谷胺酰氨(Q)；其余的均为同义突变，氨基酸没有发生改变。从氨基酸的突变可以看出：精氨酸为碱性氨基酸，带正电荷，当突变为不带电荷的谷氨酰胺，不利于SOX4基因与DNA的结合；丙氨酸为非极性氨基酸，位于疏水核内，对于维持蛋白质三级结构的稳定起重要作用，若突变为极性荷电的氨基酸－天冬氨酸，则破坏疏水作用，导致高级结构的解体，从而失去结合DNA的能力；精氨酸突变为中性氨基酸亮氨酸，同样不利于与DNA的结合；缬氨酸虽然也是中性氨基酸，但其结构要比丙氨酸大得多，因而使得整个肽链结构趋于松散，不利于与DNA的结合。所以可以推测突变导致SOX4基因与DNA的结合能力下降，影响了SOX4蛋白正常转录激活功能，导致其不能对下游调控基因的DNA序列特异识别和结合。推测这些突变可能与