【摘要】 目的 通过蛇毒抗高凝状态酶(AHCSE)、氟尿嘧啶（5-FU）对人肝癌细胞BEL-7404（简称7404细胞）、正常LO2肝细胞（简称LO2细胞）作用的比较，研究AHCSE对肝癌的作用以及探讨其可能的作用机制。
方法 应用光学显微镜、透射电镜、MTT法、TUNEL、FCM等方法观察7404细胞、LO2细胞经过AHCSE、5-FU处理后，细胞形态学、生物化学等方面的变化。
结果 7404细胞、LO2细胞经过AHCSE、5-FU处理后，发生了形态学改变；小剂量AHCSE对7404细胞具有很强的抑制作用，但对LO2细胞几乎无影响；随着剂量的加大，AHCSE对7404细胞抑制率上升不明显，但是出现对LO2细胞的抑制作用。经AHCSE作用后，7404细胞发生了凋亡，凋亡率随AHCSE浓度的增加而增加；与5-FU对7404细胞作用相似，但5-FU对LO2细胞抑制作用明显增强。
结论 AHCSE、5-FU对BEL-7404细胞均有很强的抑制作用，诱导细胞凋亡是其作用机制之一，AHCSE可能成为一种新的肝癌细胞凋亡的诱导剂。
【关键词】 蛇毒抗高凝状态酶；细胞凋亡；肝细胞癌；肝细胞
【Abstract】 Objective To investigate the efficacy of antihypercoagulability state enzyme (AHCSE) and 5-FU on human hepatocellular carcinoma BEL-7404 cells， normal hepatocellular LO2 cells and probe into its function.
Methods MTT.Phase-contrast-microscope， electron-microscopy， terminal deoxynucleotidy transferase dUTP nick and labeling (TUNEL)， flow cytometer (FCM) were conducted to observe the alteration of cell form， biochemistry variety of the AHCSEed cells (or the 5-Fued cells) of BEL-7404 cells， LO2 cells.Results The AHCSEed cells of BEL-7404， altered in their cells forms.The low dosage AHCSE had a very strong inhibition to BEL-7404 cells， nearly no efficacy on LO2 cells.With the dosage increase the rate of inhibition to BEL-7404 cells did not rise markedly， but an inhibition to LO2 cells appeared. After the action of AHCSE apoptosis took place in BEL-7404 cells， the apoptosis index increased with the increase of the dosage. It is very like 5-FUs， but 5-FUs function is very stronger than AHCSE’s.
Conclusion The AHCSE /5-FU have very strong inhibition to the BEL-7404 cells. Inducing apoptosis is one of its functions. The AHCSE may possibly become a new kind of drugs that induce apoptosis.
【Key words】 antihypercoagulability state enzyme；apoptosis；hepatocellular carcinoma；hepatocellular
蛇毒作为一种天然的药用资源，含有许多活性成分。大量资料显示，蛇毒很多组分对肿瘤有很好的抑制作用。我们从皖南山区蝮蛇粗毒中提取一种抗高凝状态酶（antihypercoagulability state enzyme，AHCSE），发现其对实验性肝癌有很强的抑制作用［1，2］，本实验进一步以BEL-7404细胞（7404细胞）、正常肝LO2细胞（LO2细胞）为对象，利用细胞体外培养技术，比较AHCSE、5-FU的抗肿瘤作用及可能作用机制。现将研究结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 药物：AHCSE用柱层析法从皖南山区的蝮蛇粗毒中提取，由皖南医学院蛇毒研究所文尚武教授提供。细胞株：人肝癌细胞BEL-7404，正常肝细胞LO2源于上海细胞生物学研究所。试剂：RPMI1640培养液（GIBCO公司），小牛血清（FCS）（杭州四季清公司），HEPES（sigma公司），胰蛋白酶（GIBCO公司），噻唑蓝（MTT）（sigma公司），二甲基亚砜（DMSO）(sigma公司)，其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 测定不同浓度AHCSE、5-FU分别作用于7404细胞、LO2细胞后不同时间内的光密度值（OD）、抑制率（IR） 基本按文献［3，4］方法进行。AHCSE、5-FU经RPMI-1640培养液稀释，分别配成1mg/ml的母液。将于培养瓶中培养了48h的传代7404细胞株用0.25%胰蛋白酶、0.2% EDTA消化后，加入含10% FCS的RPMI-1640培养液(含青霉素、链霉素各100u/ml)，将细胞配制成5×104/ml的细胞悬液，加入96孔培养板中，每孔100μl，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。待细胞贴壁生长后(约15h)，每孔分别加入不同浓度的AHCSE或5-FU 100μl，AHCSE终浓度分别为0.1、0.5、1、5、10、50、100μg/ml，5-FU终浓度分别为0.1、0.5、1、10、50、100、500μg/ml，对照组加入RPMI 1640培养液100μl；每组设3复孔。采用MTT法测定经AHCSE或5-FU作用24h、48h后各浓度组的OD、IR值：培养结束前4h加5mg/ml MTT溶液20μl，终止培养时小心吸出孔内培养液，每孔加DMSO 150μl，振荡10min，用酶联免疫检测仪（BIO-RAD）测
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