实时荧光PCR和RT-PCR方法检测登革病毒的比较研究

用MGB淬灭荧光基团标记，扩增片段长度为68bp。
   
    登革病毒RT-PCR通用引物：
   
    Den-D1： 5′ TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG　3′
   
    Den-D2： 5′ TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC　3′
   
    登革病毒荧光PCR通用引物：
   
    Den-FP： 5′ GCATATTGACGCTGGGAGAGA　3′
   
    Den-RP： 5′GGCGTTCTGTGCCTGGAAT　3′
   
    登革病毒通用探针：
   
    Den-Probe：5′ FAMCAGAGATCCTGCTGTCTCMGB　3′
   
    引物和探针均由上海基康生物技术有限公司合成及标记。
   
    1.5  病毒RNA提取  1～4型登革病毒标准株用1640培养液溶解，接种C6/36细胞，传代次，按病毒RNA提取试剂盒说明书操作，提取病毒RNA，RNA置-80℃保存备用。
   
    1.6  反转录及普通PCR
    
    1.6.1  RNA逆转录  反应总体积为20μl，在反应管内依次加入：5×缓冲液5μl，2.5mmol/L 4×dNTP 1μl，0.3μg/μl Random（Invitrogen公司生产）引物1μl，提取的RNA 12μl，AMV逆转录酶（10u/μl）1μl混匀。反应条件为：42℃ 60min→95℃加热5min→4℃保存。然后将产物放置于-20℃备用。
   
    1.6.2  PCR扩增  反应总体积为20μl，在反应管内依次加入：10×缓冲液2μl，2.5mmol/L，4×dNTP 1μl，25mmol/LMgCl2 2.5μl，通用引物D1、D2（5μmol/L）各1μl，RT产物0.5μl（Ⅰ型，Ⅱ型，Ⅳ型）、2μl（Ⅲ型，血清标本，阴性对照），Taq酶（5u/μl） 0.25μl，加H2O补足体系。反应条件为：94℃ 5min→94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，循环40次→72℃延伸10min→4℃保存。
   
    1.6.3  扩增产物电泳分析  配制含溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶，取10μlPCR产物电泳，在凝胶成像仪上观察并照相记录实验结果。
   
    1.7  实时荧光PCR  反应总体积为25μl，在反应管内依次加入：10×缓冲液2μl，10mmol/L 4×dNTP 0.75μl，50mmol MgCl2/L 2.5μl，引物Den-FP，Den-RP（10μmol/L）各0.5μl，探针Den-probe（5μmol/L）0.6μl，RT产物0.5μl（Ⅰ型，Ⅱ型，Ⅳ型）、2μl（Ⅲ型，血清标本，阴性对照），Taq酶（5u/μl）0.25μl，加H2O补足25μl体系。反应条件是：50℃ 2min→95℃ 10min→95℃ 30s→60℃ 30s，循环40次→4℃保存。采用MX4000实时荧光PCR扩增仪进行扩增，延伸阶段检测荧光。
   
    2  结果
   
    2.1  普通RT-PCR检测结果  1～4型登革病毒标准株、10份发病2周内疑似登革病毒感染病人血清，其IgM、 IgG检测为阳性，乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株进行RT-PCR检测，在511bp处1～4型登革病毒标准株都出现了目的基因条带，10份疑似登革病毒感染病人血清只有2份出现目的基因条带，其他标本都为阴性，见图1。说明此RT-PCR检测体系具有良好的特异性。
   
    注： DNA分子质量标准；1～4分别为Ⅰ～Ⅳ型登革毒株；
   
    5～13血清标本（其中5和8为同一标本）；

    
    14、15为乙脑病毒对照；-为空白对照 

                图1  登革Ⅰ～Ⅳ型毒株和血清标本PCR扩增结果
   
    2.2  登革病毒Taqman MGB PCR体系检测结果
   
    2.2.1  有效性检验  按1.7方法，分别提取登革病毒1～4标准株RNA，进行反转录的实时PCR，1～4型均观察到荧光信号增强。
   
    2.2.2  特异性分析  登革病毒1～4标准株、乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株经TaqmanMGB体系检测，只有登革病毒1～4标准株观察到荧光信号增加外，乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株均没有荧光增加信号，见图2。这证明了此TaqmanMGB

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