实时荧光PCR和RT-PCR方法检测登革病毒的比较研究
实时荧光PCR和RT-PCR方法检测登革病毒的比较研究
作者：刘建军，古丽巴哈尔，阳 帆，陈家敏，何雅青，杨 洪
【摘要】 目的 通过2种检测登革病毒方法的比较，以提高检测登革病毒的灵敏度和特异性。方法 利用Taqman MGB技术，根据登革病毒3′端非编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针，以登革热毒株作为标准，以乙脑毒株作对照，建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对10份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT-PCR及荧光PCR扩增。结果 RT-PCR检测10份临床血清标本，2份阳性，阳性率为20%。实时荧光PCR检测登革病毒与乙脑病毒无交叉反应，检测10份临床血清标本，5份阳性，阳性率为50％。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论 Taqman MGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强，可作为登革病毒的快速检测方法，应用于登革热的临床早期诊断。
【关键词】 登革病毒；RT-PCR；Taqman GMB实时PCR
【Abstract】 Objective In order to improve the sensitivity and specificity of detecting dengue viruses， two methods for detecting dengue viruses were compared.Methods Using Taqman MGB technique， a pair of universal primers and Taqman MGB probe were designed according to a highly reserved sequence of the 3′-noncoding region of dengue viruses type 1-4. Dengue virus strains were used as standard and Japanese encephalitis virus strains were used as control， the real-time PCR assay for specific and sensitive detection of the dengue viruses was established. While 10 serum specimens of ELISA positive were detected by the RT-PCR and fluorescent PCR.Results There was no cross-reaction with Japanese encephalitis virus. Of 10 specimens， 2 was positive by RT-PCR and 5 was positive by real-time PCR. The test could be completed in 4 hours.Conclusion The Taqman MGB real-time PCR assay was fast， sensitive and specific. It could be applied to the quick early diagnosis of dengue viruses.
【Abstract】 dengue virus；RT-PCR；Taqman GMB real-time PCR
登革热是流行于热带、亚热带地区的一种急性虫媒传染病，其病原体为登革病毒，近年来随着全球气候变暖和国际旅游的增多，登革病毒感染呈扩大蔓延之势，发病率不断升高。由于缺乏疫苗和有效的防治措施，因此对该疾病实行早期诊断十分必要。
登革病毒属于黄病毒科黄病毒属， 为单股正链ＲＮＡ病毒，基因组长约11ｋｂ。依抗原性不同分为1、2、3、4四个血清型(ＤＥＮ1～4)［1，2］。登革病毒感染的实验室诊断，传统方法是从患者血清中分离病毒，或用血清学方法检测病毒的特异性抗体。但病毒分离费时，检测血清抗体需分别在患者感染的急性期及恢复期采集双份血清， 同时存在广泛的交叉反应而受到干扰［3］，这些均不利于疾病的早期诊断。近年来国内外均有报道应用RT-PCR检测登革热病毒［4］，但RT-PCR方法容易造成污染，同时也存在从临床血清标本中检测登革病毒敏感性不够的问题。这就需要建立一种更敏感、特异和快速的检测鉴定方法，以实现对登革热患者的早期快速诊断，为预防控制登革热的流行赢得时间。本研究比较了利用TaqmanMGB探针技术的实时荧光PCR和RT-PCR方法检测登革病毒特异性，以期选择特异性好、灵敏度高的检测方法，达到快速诊断登革热的目的。
1 材料与方法
1.1 毒株及血清标本 登革病毒1～4型标准株由广东省疾病预防控制中心提供，乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株由成都生物制品所提供。血清标本采自深圳市近几年发病2周内的疑似登革热病人和发病10天内的疑似乙脑病人，-80℃保存。
1.2 主要试剂 病毒RNA提取试剂盒为Roche公司产品，TaqDNA聚合酶、PCRbuffer、MgCl2、随机引物购自Invitrogen公司，dNTP购自上海生工公司， AMV逆转录酶、RNaseinhibitor购自大连宝生物公司，引物和荧光探针由上海基康生物技术有限公司合成及标记，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
1.3 主要仪器设备 Centrifuge 5415D台式高速离心机购自德国Eppendorf公司， Ultrospec 2000紫外可见光蛋白核酸分析仪购自美国GE公司， 9700基因扩增仪购自美国ABI公司，Gene Genius凝胶成像分析系统购自英国Syngene公司， Mx4000荧光PCR仪购自美国Stratagene公司。
1.4 引物及探针设计 在GeneBank上检索登革病毒4个血清型中都一致的高度保守序列，根据登革病毒(DEN)聚合蛋白基因的一段高度保守序列，设计登革1～4型RT-PCR通用引物，扩增片段长度为511bp。根据DEN 3端非编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型荧光PCR通用引物和Taqman探针，探针5′用FAM报告荧光基团标记，3′
